Utente:Armin6/Cellula tumorale circolante

Le cellule tumorali circolanti (nella letteratura internazionale circulating tumor cells, CTCs) sono cellule provenienti da un tumore primario che mediante il processo di intravasazione hanno attraversato la parete di vasi sanguigni e linfatici  acquisendo così la capacità di raggiungere molteplici distretti corporei attraverso il sistema circolatorio. Le CTCs dunque costituiscono il "seme" che darà origine ad altre neoplasie (le metastasi) in organi vitali distanti, contribuendo così alla mortalità correlata al cancro.

Le CTCs furono descritte per la prima volta nel 1869 da Thomas Ashworth; egli le osservò nel sangue di un uomo affetto da cancro metastatico. Importante fu la sua seguente ipotesi: "le cellule osservate nel sangue che sono simili a quelle tumorali possono fare maggiore chiarezza sul modo in cui originano molteplici tumori nella stessa persona". Un esteso lavoro sull'analisi della morfologia delle CTCs in tumori diversi portò Ashowrth a concludere che "Una cosa è certa; che se [le CTC] provengono da una struttura tumorale pre-esistente, allora devono aver già percorso grande parte del sistema circolatorio, fino ad arrivare all'interno della vena safena interna della gamba sana".

Nella metà degli anni '90 venne sottolineata l'importanza delle CTCs nella ricerca oncologica moderna, attraverso la dimostrazione della loro presenza SOLO nelle fasi precoci della patologia oncologica. Questi risultati furono raggiunti solo grazie al contributo di Paul Liberti e Leon Terstappen.

Liberti e Leon Terstappen teorizzarono infatti che una esigua percentuale  hose results were made possible by exquisitely sensitive magnetic separation technology employing Ferrofluids (colloidal magnetic nanoparticles) and high gradient magnetic separators invented by Paul Liberti and motivated by theoretical calculations by Liberti and Leon Terstappen that indicated very small tumors shedding cells at less than 1.0% per day should result in detectable cells in blood. A variety of other technologies have been applied to CTC enumeration and identification since that time.

Tipi di CTCs

1. Le CTCs tradizionali sono cellule tumorali "confermate", con un nucleo vitale e intatto; esprimono citocheratine (indice della loro origine epiteliale); sono negative per CD45 (indice del fatto che non provengono dal midollo osseo); posseggono una morfologia cellulare eterogenea (grandi, forme irregolari); posseggono una morfologia subcellulare eterogenea.

2. Cytokeratin negative (CK-) CTCs are cancer stem cells or cells undergoing epithelial-mesenchymal transition (EMT). CK-CTCs may be the most resistant and most prone to metastasis; express neither cytokeratins nor CD45; have morphology similar to a cancer cell; and importantly have gene or protein expression or genomics associated with cancer.

3. Apoptotic CTCs are traditional CTCs that are undergoing apoptosis (cell death): Epic Sciences technology identifies nuclear fragmentation or cytoplasmic blebbing associated with apoptosis. Measuring the ratio of traditional CTC to apoptotic CTCs – from baseline to therapy – provides clues to a therapy’s efficacy in targeting and killing cancer cells.

4. Small CTCs are cytokeratin positive and CD45 negative, but with sizes and shapes similar to white blood cells. Importantly, small CTCs have cancer-specific biomarkers that identify them as CTCs. Small CTCs have been implicated in progressive disease and differentiation into small cell carcinomas, which often require a different therapeutic course.

5. CTC clusters are two or more individual CTCs bound together. The CTC cluster may contain traditional, small or CK- CTCs. These clusters have cancer-specific biomarkers that identify them as CTCs. Some studies have reported that these clusters are associated with increased metastatic risk and poor prognosis. However, one study has reported that contrary to existing consensus, at least a discrete population of these clusters are non-malignant, and derive instead from the tumor-endothelia. These circulating tumor-endothelial clusters also show epithelial-mesenchymal markers but do not mirror the genetics of the primary tumor.

Frequenza delle CTCs

Il rilevamento delle CTCs non è semplice a causa delle loro piccole dimensioni, ma può essere utile in quanto può avere notevoli implicazioni prognostiche e terapeutiche. Si stima che tra tutte le cellule che si sono "staccate" dal tumore primario, solo il 0.01% di queste può formare metastasi.

Le cellule tumorali circolanti si riscontrano in frequenze nell'ordine di 1-10 CTC per mL di sangue in pazienti con patologia metastatica. In confronto, un mL di sangue contiene diversi milioni di leucociti e un bilione di eritrociti (figura 1). La bassa frequenza di riscontro, associata alla difficoltà di identificazione delle celluleFor comparison, a mL of blood contains a few million white blood cells and a billion red blood cells, see figure 1. This low frequency, associated to difficulty of identifying cancerous cells, means that a key component of understanding CTCs biological properties require technologies and approaches capable of isolating 1 CTC per mL of blood, either by enrichment, or better yet with enrichment-free assays that identify all CTC subtypes in sufficiently high definition to satisfy diagnostic pathology image-quantity requirements in patients with a variety of cancer types. To date CTCs have been detected in several epithelial cancers (breast, prostate, lung, and colon) and clinical evidences indicate that patients with metastatic lesions are more likely to have CTCs isolated.

CTCs are usually (in 2011) captured from the vasculature by using specific antibodies able to recognize specific tumoral marker (usually EpCAM); however this approach is biased by the need for a sufficient expression of the selected protein on the cell surface, event necessary for the enrichment step. Moreover, since EpCAM and other proteins (e.g. cytokeratins) are not expressed in some tumors and can be down regulated during the epithelial to mesenchymal transition (EMT), new enrichment strategies are required.

First evidence indicates that CTC markers applied in human medicine are conserved in other species. Five of the more common markers including CK19 are also useful to detect CTC in the blood of dogs with malignant mammary tumors.

Newer approaches are able to identify more cells out 7.5 ml of blood, like isoflux or maintrac.

Approcci clinici

Al giorno d'oggi, nel campo della ricerca clinica, sono stati formulati diversi metodi per riuscire ad isolare e conteggiare le CTCs. L'unica metodologia di numerazione delle CTCs approvata alla FDA (Food and Drug Administration) è il sistema CellSearch, che si applica all'intero sistema circolatorio . Diverse sperimentazioni cliniche hanno dimostrato che la presenza delle CTCs costituisce un fattore prognostico positivo di enorme importanza per la sopravvivenza dei pazienti con:

*carcinoma della mammella allo stadio metastatico;

*carcinoma prostatico metastatico

*cancro del colon-retto metastatico. 

Detection methods

CellSearch method

This method is based on the use of iron nano-particles coated with a polymer layer carrying biotin analogues and conjugated with antibodies anti EpCAM for capturing CTCs, and on the use of an analyzer to take images of isolated cells upon their staining with specific fluorescent antibody conjugates. Blood is sampled in an EDTA tube with an added preservative. Upon arrival in the lab, 7.5mL of blood is centrifuged and placed in a preparation system. This system first enriches the tumor cells immunomagnetically by means of ferrofluid nano-particles and a magnet. Subsequently recovered cells are permeabilized and stained with a nuclear stain, a fluorescent antibody conjugate against CD45 (leukocyte marker), and cytokeratin 8, 18 and 19 (CKs). The sample is then scanned on an analyzer which takes images of the nuclear, cytokeratin, and CD45 stains. To be considered a CTC a cell must contain a nucleus, be positive for cytoplasmic expression of cytokeratin as well as negative for the expression of CD45 marker, and have a diameter larger than 5 µm. If the total number of tumor cells found to meet the criteria cited above is 5 or more, a blood sample is positive. In studies done on prostate, breast and colon cancer patients, median survival of metastatic patients with positive samples is about half the median survival of metastatic patients with negative samples. This system is characterized by a recovery capacity of 93% and a detection limit of one CTC per 7.5 mL of whole blood. Despite its sensitivity and reproducibility, the CellSearch method requires specific equipment to perform the analysis.

ISET Test

The ISET Test (Isolation by Size of Tumor cells / Trophoblastic cells) is a diagnostic blood test that detects circulating tumor cells in a blood sample. The test uses an in-vitro diagnostic system developed at INSERM, the Université Paris Descartes and Assistance Publique Hôpitaux de Paris (AP-HP) in order to isolate cancer cells from blood without loss and identify them through a diagnostic cytopathology-based approach.

Caratterizzazione ulteriore delle CTCs

Alcuni farmaci sono particolarmente efficaci contro tumori che "soddisfano" diversi requisiti. Per esempio, il Trastuzumab (Herceptina) è molto efficace nei pazienti positivi Her2 positive; lo è di meno nei pazienti Her2 negativi. Una volta che il tumore primario è stato rimosso, tuttavia, non è più possibile eseguire la tipizzazione tissutale post-biopsia che di solito descrive lo stadio corrente in cui si trova il cancro. Per ovviare a questa complicazione si utilizzano preparati istopatologici del tumore primario conservati anni fa. La caratterizzazione delle CTC può contribuire, insieme alla tipizzazione tissutale del tumore primario, a determinare il fenotipo tumorale. Questa può essere eseguita mediante:

*FISH  *Immunofluorescenza (soprattutto utilizzata per valutare lo status dei geni IGF-1R, Her2, Bcl-2, [ERG (gene)|ERG], PTEN, AR) immunofluorescence.

Se si riescono ad isolare le CTCs dal sangue allora è possibile ottenere numerose informazioni genetiche tramite la tecnica della qPCR (single cell level qPCR).

Rilevamento morfologico

L'aspetto morfologico è valutato da un professionista ed è soggetto ad ampia variazione inter-operatore. Esistono diversi metodi di numerazione di CTC everal CTC enumeration methods exist which use morphological appearance to identify CTC, which may also apply different morphological criteria. A recent study in prostate cancer showed that many different morphological definitions of circulating tumor cells have similar prognostic value, even though the absolute number of cells found in patients and normal donors varied by more than a decade between different morphological definitions.

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